quinta-feira, 13 de março de 2008

Protocolo de cruzamentos


O protocolo de cruzamentos genéticos deve ter em conta alguns cuidados básicos dos quais se destacam a utilização de linhas puras e de fêmeas virgens e a realização de cruzamentos parentais recíprocos:
Os indivíduos a cruzar devem ser provenientes de linhas puras, isto é de stocks onde todos os indivíduos são iguais para uma determinada característica, por exemplo olhos brancos, e quando cruzados entre si originam sempre esse fenótipo.
As fêmeas utilizadas no cruzamento inicial (cruzamento parental, P) devem estar virgens, isto é, ainda não terem atingido a maturidade sexual, pois caso contrário correr-se-ia o risco de terem sido fecundadas pelos machos do seu stock de proveniência; para ultrapassar este problema os frascos de stock são completamente esvaziados de insectos adultos e ao fim de 6 horas observam-se os indivíduos que entretanto eclodiram da pupa, sendo as fêmeas separadas para um novo tubo até serem cruzadas. Como os machos e as fêmeas apenas atingem a maturidade sexual decorridas 12 horas de eclosão da pupa, as fêmeas assim isoladas estarão certamente virgens.
Devem efectuar-se cruzamentos parentais recíprocos de forma a identificar logo na F1 (primeira geração filial) se algum gene estiver localizado num cromossoma sexual. Assim, se na geração parental forem cruzados machos de olhos brancos com fêmeas de corpo amarelo deve-se efectuar em paralelo um cruzamento parental recíproco de machos de corpo amarelo com fêmeas de olhos brancos.
O protocolo de cruzamentos tem de ter em conta a duração do ciclo de vida (12 dias) para evitar que as diversas gerações se misturem. Assim, depois de permanecerem 7 dias no tubo de cruzamento, os indivíduos adultos são transferidos para outro tubo, ou eliminados, para que não se cruzem com os seus descendentes, que nessa altura ainda estão na fase de ovo, larva ou pupa.





Primeiro dia:
Realizar o cruzamento parental

Sétimo dia:
Remover os progenitores do frasco (transferi-los para um novo frasco)

Décimo-quarto dia:
Observar o fenótipo da descendência F1, contar e distinguir os sexos.
Cruzar os individuos da F1 (F1 X F1) num novo frasco.

Vigésimo-primeiro dia:
Remover os adultos da F1 do frasco.

Vigésimo-oitavo dia:
Observar o fenótipo da descendência F2. contar e distinguir o sexo.

Retirar conclusões.

Protocolo Experimental



I – Como fazer a papa da Drosophila melanogaster:




Preparação da papa
Ingredientes:
- 1,125 L de água da torneira
- 300 g de farinha de milho (amarelo)
- 1 Banana

Procedimento:


Colocar uma panela com 4,5L de água ao lume. Quando a água começar a ferver, mistura-se a farinha de milho amarelo. De seguida deve mexer-se o preparado, durante aproximadamente 20 minutos, para que este não se agarre à panela e adicionar uma banana esmagada. No fim do tempo estimado, verifique se a papa já adquiriu consistência. Para isso, coloque uma colher na papa e observe se esta cai para os lados. Se tal acontecer, significa que esta ainda não está suficientemente espessa e que se deve manter ao lume mais algum tempo. Posteriormente deve-se retirar o preparado e colocá-lo num recipiente a arrefecer até ao dia seguinte.


Preparação do Tegosep M
Ingredientes
- 10g Nipagina M
- 100cm3 de álcool a 95%


Preparação do fermento
Ingredientes
- 15g fermento de padeiro
- 115cm3 de água destilada

Procedimento
Num copo, colocar o fermento e de seguida adicionar a água destilada, de modo a dissolver o fermento.

Após a realização de todos os preparados, adiciona-se 25ml de Tegosep M ao fermento e junta-se à papa, preparada inicialmente.


II – Esterilização do material:

Lista de material necessário
- 3 Erlenmeyers
- 8 Frascos cilíndricos pequenos
- 10 Frascos cilíndricos grandes
- Gaze
- Algodão
- Rolhas
- Eterizador
- Papel de filtro




III – Cruzamento das moscas:

Lista de material necessário


- 8 Frascos cilíndricos pequenos
- 10 Frascos cilíndricos grandes
- Nipagina M
- Éter dietílico
- Gaze
- Algodão
- Rolhas
- Farinha de milho amarelo
- Fermento de padeiro
- 1 Banana
- Panela
- Seringa
- Colher de pau
- Pincéis
- Eterizador
- Papel de filtro







Mutantes

Existem várias formas mutantes da Drosophila melanogaster, no entanto nós apenas iremos trabalhar com três. São elas a forma vestigial, a white e a selvagem.



Normal Fruit Flies - olhos vermelhos







White-Eyed Flies - olhos brancos









Short-Winged Flies - asas vestigiais

Aspecto


Machos:

  • Abdómen redondo


  • Abdómen predominantemente negro


  • Relativamente às fêmeas apresentam um tamanho mais reduzido




Fêmeas:


  • Abdómen bicudo


  • Abdómen com riscas negras


  • Relativamente aos machos são grandes

Ciclo de vida

O ciclo de vida da Drosophila depende das condições ambientais, no entanto, o tempo médio de vida das fêmeas é de 26 dias e de 33 dias para os machos. Deste modo, o ciclo divide-se em sete fases distintas: ovo, embrião, 1º, 2ª e 3ª fases larvar, pupa e estado adulto.
24 horas após a fertilização, eclode a primeira forma larvar que, ao fim de um dia, muda de cutícula e se transforma numa larva de segunda fase. Decorrido mais um dia a larva muda novamente de cutícula e transforma-se numa larva de terceira fase que aumenta de tamanho ao longo de 3 dias.

Cerca de 5 dias após a fertilização, a larva deixa de se alimentar e começa a ficar imóvel, formando uma espécie de casulo onde sofre um conjunto de alterações designadas de pupação. Após este período eclode uma nova fase larvar: a pupa.
Dentro da pupa a larva sofre uma metamorfose durante a qual ocorre a degradação dos tecidos larvares e a proliferação dos discos imaginais. (Os discos imaginais são grupos de células que irão originar as estruturas do adulto).
Aproximadamente 10 dias após a fertilização, uma mosca adulta emerge do interior da pupa,
atingindo a maturidade sexual ao fim de 12 horas.

Morfologia externa

  • As larvas formam um casulo (pupa). A pupa é um estado imóvel ondeanimal que não se alimenta


  • Tem um par de asas muito desenvolvidas


  • 3 pares de patas


  • Um par de antenas que terminam em cristas


  • 2 olhos vermelhos multi-facetados


  • Conjunto de pêlos muito grossos

Cromossomas

A Drosophila possui, para além dos 4 pares de cromossomas, cromossomas politénicos. Estes são um tipo particular de cromossomas que só estão presentes nas células das glândulas salivares e do intestino das larvas da mosca, tendo como principal função produzir uma grande quantidade de uma cutícula que envolve a larva, sendo para isso necessário as múltiplas cópias de cadeias de DNA capazes de uma grande produção de proteínas necessárias á formação da mesma. Desta forma, podemos afirmar que a sequenciação do genoma e manipulação genética têm permitido aos cientistas estudar um modelo biológico simples na esperança de compreender os princípios que se podem aplicar a modelos complexos.

Vantagens da sua utilização


  • Pequenas dimensões


  • A obtenção e manutenção no laboratório é fácil, pouco dispendiosa e ocupa pouco espaço


  • Período de vida curto, ao qual se associa uma alta capacidade de proliferação


  • Apresenta apenas quatro pares de cromossomas somáticos (2n=8)


  • Apresentam cromossomas heterossómicos gigantes que podem ser utilizados em estudos citológicos e alterações cromossómicas


  • Conhecem-se numerosos mutantes espontâneos. Mutações induzidas podem obter-se facilmente

Taxonomia


Reino: animalia
Filo: artropoda
Classe: insecta
Sub classe: pterygota
Ordem: diptera
Sub– ordem: cyclorrapha
Família: drosophilidae
Género: Drosoplila
Espécie: Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster

Drosophila Melanogaster é um díptero, vulgarmente conhecido por “mosca da fruta” ou “mosca do vinagre”, comummente encontrada em adegas e lugares onde haja fruta em fermentação.
Drosophila significa “amigo da fermentação” e Melanogaster significa “abdómen negro”. Foi utilizada pela primeira vez por T. H. Morgan e W. Castle em 1900, e tem-se revelado um material conveniente para estudos genéticos de organismos diplóides, no laboratório atendendo às seguintes características: